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定量NMRを用いた加工食品中の食品添加物分析
日本大学生物資源科学部 食品生命学科
専任講師 大槻 崇

1.はじめに

核磁気共鳴(NMR)は、スペクトル上の共鳴シグナルの化学シフトやシグナルの多重度、分裂幅、面積強度などを通じて測定対象物質に関する多種多様な構造情報を与える。またNMRは測定対象物質を非破壊で分析できることから、天然化合物、化学合成品など様々な有機化合物の構造決定等における重要なツールとして広く使用されている。さらに近年では、超伝導マグネットの高磁場化、プローブの改良などに伴い、NMRは定性にとどまらず実用的な定量分析装置としても認知されつつある。このNMRを使った定量法、いわゆる定量NMRは、①測定対象物質と同一の定量用標品が不要、②定量のための検量線が不要、③計量計測トレーサビリティを確保した測定対象物質の含量の算出が可能など、分析の効率性、迅速性、得られる定量値の信頼性の向上に大きく貢献できる新たな定量法として注目を集めている1,2)。また、このような特長を背景に、定量NMRは生薬指標成分や食品添加物の定量用試薬(標品)の純度分析法など、公的な分析法への採用も進んでいる3-6)
 著者は、ここ数年、食品関連成分を対象とした定量NMRによる定量分析法の確立に関する検討を行っている7-9)。本稿では、その一例として、1H-NMRを用いた定量NMR(1H-qNMR)による加工食品中の食品添加物分析について紹介する。なお、1H-qNMRの原理等については、本e-Magazine 2017年3月号に掲載された著者らの拙稿をご参照いただきたい。

2.加工食品中の食品添加物分析10)

日本では食品添加物の安全性や品質を確保する目的で、食品添加物の性状、含量(純度)などの成分規格や食品添加物を使用できる食品の種類、使用量などの使用基準などが設定され、これらの規格、基準が守られているかを監視するための分析法が別途規定されている。このうち、食品中の使用量を試験するための分析法いわゆる「食品中の食品添加物分析法」では、主に液体クロマトグラフ等の機器が用いられるが、定量には測定対象物質と同一かつ純度が正確な定量用標品が必要である。しかし、計量学的に妥当な手順によって純度が算出された認証標準物質(CRM)は非常に少ない。このため、液体クロマトグラフィー等の相対定量法では、試薬メーカーの標準品が一般的に利用されている。しかし、この純度は自社規格により保証されたもの、すなわち計量学的に正確とは言えず、結果として定量値の信頼性が損なわれる可能性を否定できない。また、食品や測定対象物質によっては煩雑な前処理や低回収率等の問題点もあり、その改善が望まれている。 1H-qNMRは検出手法が測定対象物質の吸光や蛍光などの物性に依存しない測定法であるため、CRMのような標準物質を内標準物質として用いることにより、様々な有機化合物に対して分析値の信頼性を確保した絶対定量が可能である。また、測定対象物質の定量用シグナルが、その分子内の他のシグナルや夾雑物に由来するシグナルと十分に分離されていれば、測定対象物質の精確な定量が可能である。このため、多段階のクリーンアップや誘導体化等の前処理が不要となる可能性がある。従って、1H-qNMRは迅速性、簡便性、選択性の面で従来法よりも優れた分析法と言える。またこのような特長をもつ1H-qNMRの食品添加物分析への応用は、食品添加物の使用基準の評価における分析値の計量計測トレーサビリティの確保、ひいては国民の要望が高い食品添加物の安全の一層の確保に貢献できると考えられる。
 そこで、1H-qNMRを用いた加工食品中の食品添加物分析法の確立を目的とした検討のうち、デヒドロ酢酸およびアセスルファムカリウム分析を例に、性能評価や妥当性確認など分析法の確立における一連のプロセスを以下に紹介する。

3.1H-qNMRを用いた食品中のデヒドロ酢酸ナトリウム分析11)

デヒドロ酢酸ナトリウムは、保存料として使用が認められた食品添加物であり、日本ではバター、チーズ、マーガリンへの使用基準が設けられている。
 加工食品中の食品添加物分析では、抽出、精製、場合によっては濃縮操作などの前処理により試験溶液を調製することが一般的である。デヒドロ酢酸ナトリウムでは、前処理として主に水蒸気蒸留法が利用されている12)。しかし、この方法を1H-qNMRの前処理に利用することは困難と考えられた。すなわち、1H-qNMRでは、水を多く含む試料を測定した場合、水由来の巨大なシグナルが測定対象物質のシグナルの帰属や定量の妨害となる。従って、この問題を回避するためには、得られた留液を減圧乾燥させ、完全に水分を除去した試料を調製する必要があるが、操作に多大な時間を要することが考えられた。そこで、著者は前処理として、試料を精秤後、飽和食塩水、10%硫酸、ジエチルエーテルを用いてホモジナイズし、遠心分離後の上層(ジエチルエーテル層)について減圧濃縮等の操作を行い、最終的に1H-qNMR用の試験溶液を調製する方法を用いることとした。この方法では、デヒドロ酢酸ナトリウムは、抽出操作時の加水分解によりデヒドロ酢酸に変換される。このデヒドロ酢酸は上層へ移行するため、調製される試験溶液への水の混入は極力抑制できるものと考えられた。
 まず、この前処理と1H-qNMRを組み合わせた分析法の真度、精度を明らかにするため、デヒドロ酢酸ナトリウムの使用が認められているバター、チーズ、マーガリンについて、使用基準の上限濃度(0.5 g/kg)及び定量下限付近の濃度(0.13 g/kg)の2段階で添加回収試験を行った。なお、定量に際しては、定量に用いるシグナルのS/N、シグナルの多重度、測定対象物質のシグナルと夾雑物由来のシグナルが十分に分離されていることが非常に重要である。 デヒドロ酢酸の場合、図1に示すように、δH 6.03(H-5)、δH 2.56(H3-7)、δH 2.22(H3-8)に構造中の水素に由来するシグナルがそれぞれ観測される。このデータを基に各食品から調製された試験溶液のNMRスペクトルを確認したところ、全ての試料でδH 6.03(H-5)のシグナルが夾雑物のシグナルと十分に分離していることが判明した(図2)。そこで、回収率はこのシグナルを用いて算出することとした。その結果、表1に示すように、両濃度での各試料からの回収率は90%以上、併行精度(RSD)は4.6%以下と良好であった。また、本法の室内精度を明らかにするため、試料毎に同様の添加回収試験を1日に2併行で5日間繰り返し、得られたデータの一元配置の分散分析によりその精度を算出したところ、4.4~8.2%と良好な結果が得られた。

図1.デヒドロ酢酸の化学構造および1H-NMRスペクトル
図1.デヒドロ酢酸の化学構造および1H-NMRスペクトル
測定溶媒:重アセトニトリル
図2.デヒドロ酢酸を添加した各食品の1H-NMRスペクトル
図2.デヒドロ酢酸を添加した各食品の1H-NMRスペクトル
*:定量用シグナル,IS:内標準物質(1,4-BTMSB-d4),測定溶媒:重アセトニトリル
表1.各食品における添加回収試験結果(n=3)
表1.各食品における添加回収試験結果(n=3)

次に市販食品分析への本法の有用性を明らかにするため、デヒドロ酢酸ナトリウムの使用が表示された2種の加工食品(バター,マーガリン)について分析し(図3)、得られた結果を通知試験法12)(試験溶液の調製:水蒸気蒸留,分析:液体クロマトグラフィー)と比較した。その結果、両試料ともに本法と通知法により得られたデヒドロ酢酸ナトリウムの測定値はほぼ同等であり、本法は通知法と同程度に正確な定量結果を与えることが示された(表2)。

図3.デヒドロ酢酸ナトリウムの使用が表示された食品の1H-NMRスペクトル
図3.デヒドロ酢酸ナトリウムの使用が表示された食品の1H-NMRスペクトル
*:定量用シグナル,IS:内標準物質(1,4-BTMSB-d4),測定溶媒:重アセトニトリル
表2.2つの方法により算出された各食品中のデヒドロ酢酸ナトリウム含量(n=3)
表2.2つの方法により算出された各食品中のデヒドロ酢酸ナトリウム含量(n=3)

4.1H-qNMRを用いた食品中のアセスルファムカリウム分析13)

アセスルファムカリウムは甘味料の1つであり、日本では菓子、漬け物、果実酒、清涼飲料水のみならず「その他の食品」に対しても使用基準が設けられており、幅広い食品に対して使用が可能な食品添加物である。このアセスルファムカリウムを対象とした1H-qNMRを用いた分析法を確立するにあたり、試験溶液は、デヒドロ酢酸ナトリウム分析法の前処理の一部を変更して調製した。
 まず、本法の真度、精度を明らかにするため、アセスルファムカリウムの使用が認められている食品のうち12種について、各食品の使用上限濃度及び定量下限付近の濃度(0.13 g/kg)で添加回収試験を行った。なお、回収率は、アセスルファム(抽出操作時にアセスルファムカリウムは加水分解によりアセスルファムへ変換される)の1H-NMRスペクトル(図4)、定量用シグナルのS/N、多重度、夾雑物由来のシグナルとの十分な分離などを考慮し、δH 6.04(H-5)に観測されたシグナルより算出した(図5)。その結果、両濃度における回収率は、すべての試料で88.4%以上、併行精度は5.6%以下と良好な結果が得られた(表3)。また、食品3種(チューインガム,アイスクリーム,しょうゆ漬け)を選択して本法の室内精度を評価したところ、全ての濃度、試料において2.0~4.8%であり、本法は加工食品中のアセスルファムカリウム分析において、十分な真度及び精度を有する分析法と考えられた。

図4.アセスルファムの化学構造および1H-NMRスペクトル
図4.アセスルファムの化学構造および1H-NMRスペクトル
測定溶媒:重ジメチルスルホキシド
図5.アセスルファムを添加した各食品の1H-NMRスペクトル
図5.アセスルファムを添加した各食品の1H-NMRスペクトル
*:定量用シグナル,IS:内標準物質(DSS-d6),測定溶媒:重ジメチルスルホキシド
表3.各食品における添加回収試験結果(n=3)
表3.各食品における添加回収試験結果(n=3)

また、アセスルファムカリウムを含有する加工食品への本法の適用性を明らかにするため、 その使用が表示された5種の加工食品を分析し(図6)、得られた定量値を通知試験法14)(試験溶液の調製:透析,分析:液体クロマトグラフィー)と比較した。その結果、すべての試料で本法と通知試験法の結果はほぼ同等であり、本法は通知試験法と同程度に正確な定量結果を与えることが判明した(表4)。なお、本法は、分析時間が1検体あたり60分程度と通知試験法(デヒドロ酢酸分析: 125分,アセスルファムカリウム分析:25~49時間)に比べ大幅に短縮できた。

図6.アセスルファムカリウムの使用が表示された食品の1H-NMRスペクトル
図6.アセスルファムカリウムの使用が表示された食品の1H-NMRスペクトル
*:定量用シグナル,IS:内標準物質(DSS-d6),測定溶媒:重ジメチルスルホキシド
表4.2つの方法により算出された各食品中のアセスルファムカリウム含量(n=3)
表4.2つの方法により算出された各食品中のアセスルファムカリウム含量(n=3)

5.まとめ

本稿では1H-qNMRによる加工食品中の食品添加物分析を例に、定量NMRのアプリケーションを述べさせていただいた。現在の食品関連物質の分析では、クロマトグラフィーが主流であり、1H-qNMRが感度や測定コストなどの点でやや劣ることは否めない。しかし、クロマトグラフィーにも定量用標品や分離機構の限界などの問題が存在する。1H-qNMRは迅速性や得られる定量値の信頼性の向上などに資するだけではなく、定量用標品の入手が困難な測定対象物質についても、その化学シフトさえわかれば、1H-qNMRで絶対定量が可能となるなど非常に優れた特長を有している。また、1H-qNMRはシグナルの分離機構がクロマトグラフィーとは全く異なるため、クロマトグラフィーで分離が困難な測定対象物質についても本法での定量の可能性が期待できる。どちらの分析法が良いというわけではなく、分析法の利点と分析の目的に応じて使い分け、時には相補的に利用することにより、様々な分野で利用されている1H-qNMRを含む定量NMR15-17)の適用範囲は更に拡大するだろう。
 なお、本稿で紹介した内容は、著者が国立医薬品食品衛生研究所在職時に実施したものである。ご指導、ご協力を賜りました食品添加物部の先生方に厚く御礼を申し上げます。

参考文献

1  N. Sugimoto, M. Tahara, T. Suematsu & T. Miura: Food Hyg. Saf. Sci., 53, J-228 (2012).

2  合田幸広:医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス,44,753 (2013).

3  第十七改正日本薬局方(厚生労働省)

4  平成23年厚生労働省告示第307号(2011)“食品,添加物等の規格基準の一部を改正する件” 平成23年8月31日.

5  平成25年厚生労働省告示第45号(2013)“食品,添加物等の規格基準の一部を改正する件” 平成25年3月12日.

6  平成25年厚生労働省告示第268号(2013)“食品,添加物等の規格基準の一部を改正する件”,平成25年8月6日.

7  T. Ohtsuki, K. Sato, N. Sugimoto, H. Akiyama & Y. Kawamura: Anal. Chim. Acta, 734, 54 (2012).

8  T. Ohtsuki, K. Sato, N. Sugimoto, H. Akiyama & Y. Kawamura: Talanta, 99, 342 (2012).

9  T. Ohtsuki, A.Tada, M. Tahara, T. Suematsu & N. Sugimoto: Applications of NMR Spectroscopy, 4, 222 (2016).

10 大槻崇:化学と生物,52,622 (2014)

11 T. Ohtsuki, K. Sato, N. Sugimoto & H. Akiyama: Food Chem., 141, 1322 (2013).

12 厚生労働省医薬食品局食品安全部基準審査課長通知 “「食品中の食品添加物分析法」の改正について” 平成22年5月28日,食安基発0528第3号(2010).

13 T. Ohtsuki, K. Sato, Y. Abe, N. Sugimoto & H. Akiyama: Talanta, 131, 712 (2015).

14 厚生労働省医薬局食品保健部基準課長通知 “食品中のアセスルファムカリウム分析法について” 平成13年12月28日,食基発第58号(2001).

15 Y. Jadeja, B. Chomal, M. Patel, H. Jebaliya, R. Khunt & A. Shah: Magn. Reson. Chem.,55, 634 (2017)

16 G. Assemat, F. Dubocq, S. Balayssac, C. Lamoureux, M. Malet-Martino & V. Gilard: Forensic Sci Int., 279, 88 (2017).

17 R. Watanabe, C. Sugai, T. Yamazaki, R.Matsushima, H. Uchida, M. Matsumiya, A. Takatsu & T. Suzuki: Toxins, 8, 294 (2016).

    
略歴

大槻崇 (おおつき たかし)
日本大学生物資源科学部 食品生命学科 専任講師

略歴
2000年3月 日本大学 生物資源科学部 食品科学工学科 卒業
2005年3月 千葉大学 大学院医学薬学府 創薬生命科学専攻 後期3年博士課程 修了
2005年4月 千葉大学 大学院薬学研究院 助手
2007年4月 同 助教
2009年2月 国立医薬品食品衛生研究所 食品添加物部 研究員
2010年4月 同 主任研究官
2016年4月 日本大学 生物資源科学部 食品生命学科 専任講師
現在に至る

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