乳酸菌の微生物の共生による食品変敗の原因は食品工場の空中浮遊微生物であり、その空中浮遊微生物は食品工場の床や側溝などより分散されているから、床や側溝を殺菌することにより乳酸菌による食品変敗は著しく減少することが経験的に知られている。

このため乳酸菌による食品変敗を防止するために、食品工場の床や側溝の殺菌に塩素系の薬剤が使用され効果を上げてきたが、残留するために、長年の使用により乳酸菌や大腸菌群の特定の微生物において耐性菌が出現してきた。特に1996年の夏期において大腸菌O－157による食中毒が多発し、その多くの汚染源が食品工場内であるとされた。

乳酸菌はブドウ糖、ショ糖、乳糖を資化して乳酸や酢酸を生成する乳酸発酵を行う細菌であり、一般的には糖質を発酵して乳酸等を生成してエネルギーを獲得する。また、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、ブドウ糖があれば酸素のない状態でも良好に生育する。

また、発酵性のある酵母は生育環境が乳酸菌とほぼ同じで、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖等を資化し、でん粉質やタンパク質を他の分解酵素を利用して分解吸収して発酵することでアルコールと炭酸ガスを生成し、嫌気下で生育できる。さらに、酵母は好気下ではグリセロールやアルコール、乳酸、酢酸を分解して、生育する性質を有する。

多くの食品工場において長年の間、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素化合物、エチルアルコール等のアルコール類、ヨードホール等のハロゲン化合物、酢酸等の有機酸類が殺菌に効果を上げている。しかし、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素化合物は強力な殺菌剤であるが、長年の100～500ppmの使用により乳酸菌（Lactobacillus、Enterococcus、Lactococcus、Leuconostoc, Pediococcus）に耐性菌が生じている。

食品の微生物変敗では乳酸菌が他の微生物のパートナーになっていることが多い。乳酸菌と他の微生物の間での共生には、お互いを排除しようとする抗性とそれぞれの生育を確保する併存がある。乳酸菌と共生する他の微生物は、その生育に乳酸菌が絶対に必要であるとはいえない。共生はそれに関わる微生物の双方が利益を得るという共生もあるが、一方の微生物のみが利益を得て、他方の微生物は特別に利益を得ていない場合もある。

乳酸菌と他の乳酸菌との共生により食品変敗が生じる場合がある。共生の機構を細胞レベルで考えると細胞内共生と細胞外共生がある。食品変敗で多く見られるのは細胞外共生であり、細胞内共生にはミトコンドリアなどの真核細胞の細胞内小器官がある。

食品は乳酸菌、酵母、カビなど複数の微生物が共生している。これらの微生物系では①一方の微生物は他の微生物が生産する物質を基質として資化することにより生育に不利となる物質を除去する。②また他の微生物が分泌する物質を生育のために資化する。③さらに他の微生物の生産物を資化することにより一方の微生物の生育が促進される。以上の3つの共生方法がある。食品業界では乳酸菌と酵母の共生が圧倒的に多く、上記3つの共生方法が各食品において行われている。

日本酒醸造は乳酸を添加して酵母を培養した速醸酛を用いて行われることがあるが、従来の生酛作りにおいては低温で酵母を培養することにより、硝酸塩還元菌を増殖させて亜硝酸を生成させ、その後Leuconostoc mesenteroidesやLactobacillus sake等を増殖させて乳酸を生成させる。この亜硝酸と乳酸により雑菌を死滅させて清酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）を増殖させて清酒を醸造してきた。日本酒もろみ由来の乳酸菌と清酒酵母が共生すると酵母の生育や呼吸能が低下することも知られてきた¹⁾。また、腐造日本酒もろみ由来の乳酸菌Lactobacillus plantarumと清酒酵母を共培養するとそれらが共凝集する²⁾。

鹿児島県の福山酢のもろみからは、Lacobacillus plantarum及びSaccharomyces cerevisiaeをはじめとする種々な乳酸菌と酵母が分離されており、これらの菌の中には共培養するとバイオフィルムを形成する組み合わせが存在し、これらは高い共凝集活性を有する³⁾。

でん粉系及びタンパク質系加工食品では乳酸菌と酵母が存在すると斑点の生成が早いことが知られている。乳酸菌はカタラーゼを保有せず、酸化ストレスに対する感受性が高いが、酵母はカタラーゼを保有しており、乳酸菌が好気的環境で生育できる要素となる。

乳酸菌と共生微生物の食品変敗に関しては、乳酸菌の共生特性、乳酸菌と酵母の共生による増殖促進、加工食品の乳酸菌と酵母の共生による変敗現象及び防止対策が詳しく述べられている^4,5)。

食品変敗の原因となる場合が多い。ロシアのコーカサス地方の伝統的な発酵乳においてLactobacillus kefiranofaciensが多糖を生産し、酵母と共にケフィール粒と呼ばれる共生体を形成している。この多糖は、ケフィランと呼ばれ、保湿性や免疫賦活などの有用な機能をもつため、その生産方法が検討されてきた。しかし、この乳酸菌を純粋培養すると、乳酸の蓄積と共にケフィラン生成量は著しく低下してしまう。そこでCheirsilpら^6,7)は、乳酸を炭素源として乳酸資化が良好で乳糖を資化しないSaccharomyces cerevisiae と、この乳酸菌を好気的に共培養することによりケフィランの生産能を向上させている。更にTadaら⁸⁾は、乳酸菌による乳酸生産と酵母による乳酸資化のバランスがとれるように乳酸を添加することによって純粋培養時の2/3の培養時間でケフィランの対糖収率と生産量を共に1.5倍に向上させている。

乳酸菌と酵母の共生により増殖が促進される場合が多く、一般に加工食品等で増殖する酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeは多糖類、タンパク質、脂質を分解する酵素を菌体外に分泌できず、乳酸菌はこれらの酵素を菌対外に分泌する場合が多いので共生が成り立つと考えられる。

ウイスキーに限らずビール、ワイン、清酒など、アルコール類の醸造では酵母のみならず乳酸菌も関与する。清酒のLactobacillus sakeやワインのOenococcus oeniはマロラクチック発酵でリンゴ酸を乳酸に乳酸菌が変換する。醤油の乳酸菌と酵母の共生による場合では、麹の糖化酵素によって生成した糖類をTetragenococcus halophilusが資化して生育し、その生育により環境が整えられてからZygosaccharomyces rouxiiが生育する。

食品での微生物の挙動を考える場合、複数の微生物種が食品環境中でお互いに栄養的に補っている細胞外共生が普遍的である。実際にアルコール類の醸造における乳酸菌、酵母、酢酸菌、麹カビの関係や乳製品製造における乳酸菌、酵母、カビにおける栄養的補完関係は細胞外共生である。ビールはホップとともに麦汁を煮沸する工程があり、雑菌は完全に殺菌され、発酵は酵母が単独で行う。しかしモルトウイスキーの場合は63～65℃で糖化された麦汁は、ろ過後ただちに冷却されて殺菌されることなく発酵槽に送られる。このため、原料あるいは工程由来の乳酸菌が発酵工程に移行する。このためモルトウイスキーの発酵は酵母のみならず、乳酸菌も主要な微生物として発酵に関与している。モルトウイスキーのこれらの乳酸菌の存在は、アルコール収率を低下させる原因である。しかし乳酸菌は香味の向上に寄与している。

これまでモルトウイスキーのもろみからはLactobacillus fermentum、L.brevis、L.plantarum、L. casei、Streptococcus lactis、Leuconostoc paramesenteroides 等の乳酸菌が検出されている⁹⁾。ウイスキーの発酵のフェーズごとに乳酸菌を分離し、それらの挙動をオリゴ糖との関係で検討した結果、発酵開始時には乳酸菌の優勢種としてL.casei が酵母と共存しているが、接種された酵母の菌数が多い時はL.caseiはpHの低下等の環境の変化に対応できないために増殖できない。発酵初期から中期は酵母によるアルコール発酵が中心である。しかし酵母の資化性糖類が枯渇すると酵母は死滅していき、代わってL.fermentumが主要な微生物となる。L. fermentum は酵母が資化できなかった2糖類を主な糖源として0.2%程度の乳酸を生成する。これらの2糖類も枯渇し、酵母の自己消化が進行するとこれらの成分がもろみの中に溶出してくる。そうするとL. acidophilus が3糖類以上のオリゴ糖を主要な糖源として増殖し、さらに乳酸を0.2～0.3％生成する。モルトウイスキーの醸造に関して乳酸菌に汚染されるとアクロレインやジアセチルなどが生成されオフフレーバーとなる場合があるが、乳酸菌が原料中のオレイン酸やパルミトオレイン酸をそれぞれ、10-ヒドロキシステアリン酸と10-ヒドロキシパルミチン酸に変換し、それらを酵母がγ-ドデカラクトンとγ-デカラクトンに変換する。

麦汁は酵母のみならず乳酸菌にとっても豊富な栄養源であるが、適切に管理された発酵では酵母と乳酸菌の競合は起こらない。酵母と乳酸菌が共生することにより全ての糖源を枯渇させて品質を向上させている⁹⁾。

　L. fermentum は3糖類以上のオリゴ糖の資化能力がないのに対して、L. acidphilusは3糖類以上のオリゴ糖の資化能力があり、酵母が死滅後の自己消化による分解物を栄養源として要求する。

液体培地上では目的菌は検出され、菌数を推定できるが固体培地上では全く検出できない事例が多くある。食品中で変敗原因菌を検出する目的で固体培地での計算上で検出できる一定希釈段階に希釈すると全く検出されないことがある。これは食品中に存在している他の微生物がコロニー形成に必須であるためである。固体培地上ではある希釈段階で全く検出されなくなる原因は共生微生物の影響である（SN効果）。SN効果を解明するためには、微生物の形態を観察するとよい。乳酸菌の変敗はこのSN効果による場合が多い。

パンの発酵中におけるPenicillium roquefortiの汚染防止に、Lactobacillus plantarumとWicherhamomyces anomalusの共生は有効であった¹⁰⁾。

3.1 和菓子の微生物変敗と制御

以前は和菓子の変敗を起こさせる微生物の中心は酵母であり、変敗酵母とは、製造された和菓子が保存、流通段階において好ましくない現象を発生させる酵母のことである。最近では乳酸菌が酵母による変敗を拡大させている。植物性原材料を使用する和菓子は糖類を多量に含有し、酵母と乳酸菌により変敗が起きやすい。その変敗現象は、固体食品では菌体付着による斑点生成、アルコール発酵、ガス発生、エステル生成、酸生成等が多い。また酵母は有機酸類を資化する場合が多く乳酸菌の増殖を促進する。

和菓子のpH調整に用いられている酢酸、乳酸、クエン酸が資化されてpHが高くなり、乳酸菌の増殖が促進される場合もある。さらに酵母は保存料に対しても抵抗力のあるものが多く、Rhodotorulaに属する数種の酵母は0.25%の安息香酸を炭素源としてpH4.5でよく増殖し、Saccharomyces roseiは0.25%のプロピオン酸（pH4.5）、Brettanomyces intermediusは0.1%のソルビン酸存在下で良好に増殖するするとともに乳酸菌の増殖を促進する。このように乳酸菌が存在すれば酸性保存料等で酵母の増殖を阻止することは極めて困難である。しかしこれらの酵母や乳酸菌により和菓子が変敗しても和菓子が有毒化して食中毒の原因になることはほとんどない。酵母の代謝産物には毒性がないし、一部の酵母（Candida albicans）において酵母菌自体に病原性があるといっても細菌類や他の真菌類で起こるように、酵母自身が食物を通じて感染症や中毒症の原因になることはない。

最近の和菓子は脱酸素剤、粉末エタノール剤等の使用が多くなってきたため、変敗微生物（乳酸菌、酵母等）と常在微生物（細菌等）との関係が複雑になってきた。また、酸素透過度の低い包装材料で包装し、脱酸素剤を封入した包装食品に乳酸菌や酵母が原因である異臭、白斑点生成現象がしばしば見受けられるようになってきた。

酵母の酸素呼吸によってグルコースの一部が炭酸ガスと水になることをパスツール効果と呼び、グルコースの存在によって酸素呼吸が抑制され、アルコール発酵が起きる現象をクラブツリー効果と呼ぶ。またクラブツリー効果は絶対好気条件下でのアルコール発酵の出現と定義される。酵母は一般的にアルコール発酵を行い1モルのグルコースを2モルずつのエタノールと炭酸ガスに変換する。しかしSaccharomyces cerevisiaeは、エタノールやグリセンなど発酵によって利用できない化合物と共にグルコースをも呼吸によって利用出来る代謝能力を備えている。0.1%以下のグルコース存在下で、空気の供給のもとでそれを利用して炭酸ガスと水に変換する。Saccharomyces cerevisiaeは、生育の条件により発酵と呼吸を交互に切り替えることができる。つまり好気、グルコース制限下で生育した菌体に充分量のグルコースを添加すると、ただちにアルコール発酵が起き、低濃度のグルコースは発酵しているところに通気するとその発酵能力が低下し、それとともにグルコースの一部が呼吸によって炭酸ガスと水になる。このため好気、グルコース制限下でグルコース濃度を徐々に上げると、ある時点からアルコール発酵が起き、その際呼吸は制限されることなく継続する。このパスツ－ル効果はパン酵母の製造に利用され、このプロセスでは酵母は強い通気のもとで低濃度のグルコース存在下で培養して、エタノールの生成量を最小にとどめ、菌体の収量を高めている。食品の酵母による変敗現象はクラブツリー効果を示す酵母か否かにより変敗の様相は著しく異なる。クラブツリー効果を示す酵母はSaccharomyces cerevisiae、Torulopsis glabrata、Schizosaccharomyces pombe等があり、糖の豊富な植物素材より分離されており、クラブツリー効果を示さない酵母にはSaccharomyces  rosei、Candida utilis、Hansenula nonfermentans、Kluyveromyces marxianus、Kluyveromyces fragilis等がある。このため糖濃度が低い状態でSaccharomyces cerevisiaeの培養を行った場合は、クラブツリー効果を示さないCandia utilis等の野生酵母により汚染される場合がある。グルコースが高濃度の場合はSaccharomyces cerevisiaeはグルコースをどんどん取り込み、クラブツリー効果につながるのに対し、グルコース濃度が低い場合は、両酵母間でグルコースの取り込みの競争が起きる様な状態ではCandia utilisが有利となり、優先する。また食品の酵母による変敗は糖を発酵するか否かにより変敗の様相が全く異なる。食品の中からは糖を全く発酵する能力を持たない酵母も多く検出される。Rhodotorula属とCryptococcus属酵母の全部と、Candida属、Torulopsis属酵母の一部である。このような酵母は生育に必要なエネルギーの供給は全て呼吸的代謝に依存している。Debaryomyces属とPichia属の一部は強い呼吸と弱い発酵能を有しており、Saccharomyces  carlsbergensisは弱い呼吸と強い発酵能を有し、Torulopsis pintolopesiiは呼吸能が全く欠けて発酵によるエネルギーだけに依存する。食品の酵母による変敗の原因の90％以上が食品素材からの一次汚染及び製造工程における二次汚染である¹¹⁾。また、自然界には多くの乳酸菌が存在しておりこれらが他の微生物と共生して食品の変敗原因となっている場合が多い¹²⁾。

棹物菓子の場合、脱酸素剤の使用によりWicherhamomyces anomalus、Kluyveromyces marxianusの増殖が抑制され、特に炭酸ガス発生タイプの脱酸素剤において著しい。しかし嫌気条件下では乳酸菌や酵母の生育に及ぼす影響は少ない。従来、包装袋が膨張し、エタノール臭が生成して変敗したら酵母であると言われてきたが、現在では酵母と乳酸菌の共生による影響である。酵母細胞の周囲に乳酸菌が付着している。このため酵母が10²～10³/gで膨張し、エタノール臭が出ている例はほとんど乳酸菌共生による。カビや酵母の真菌は乳酸菌と共生して和菓子変敗を増強する（SN効果）。表1に和菓子の乳酸菌及び酵母の共生による変敗を示した¹³⁾。

饅頭類（紅葉饅頭、田舎饅頭、大島饅頭、酒もと饅頭、上用饅頭）は脱酸素剤を封入しているが、表面にダークグリーンから黒色の斑点が生成することが多い。これはCladosporium cladosporioides、Cladosporium herbarum、Cladosporium sphaerospermum　が原因の場合が多い。脱酸素剤を入れたアンドーナツの表面の白色斑点はCandida pelliculosa（テレオモルフ名Wicherhamomyces anomalus）であった。

ミニドーナツから検出された白斑点はTrichosporonoides nigrescensであり、ジャムの白色物質はEurotium halophilicumが原因であった。

脱酸素剤を使用した生和菓子のシェルフライフは30℃で１日であり、草もちは2日、桜餅、田舎饅頭、大福餅、酒もと饅頭、大島饅頭は3日、上用饅頭は5日であった。ミックスピザは脱酸素剤を使用して5℃で5日保存後に異臭が生成した。乳酸菌（Enterococcus faecalis）及び酵母の増殖が著しいことを認めた。

 

表1　和菓子の乳酸菌及び酵母による変敗現象¹³⁾

 

3.2　液化豆腐の微生物変敗

豆腐成分の変化を製品、原材料及び製造工程中の半製品について検討した結果、これらの値は通常の値であり液化は製品になった後に生成したものと思われる。また正常な豆腐と液化豆腐の一般成分分析を行った結果、液化豆腐は正常な豆腐に比較して脂質、糖質が減少していることが認められ、無機塩類は正常な豆腐とほぼ同じであった。しかし液化豆腐はpHが4.30と著しく低下し、ブリックスも22％と著しく低下したことから微生物の増殖があったものと考えられる。凝固剤として用いられる硫酸カルシウムや塩化マグネシウムのカルシウムやマグネシウムが微生物の生育に影響を及ぼしていると考えられるため、凝固剤の差異による保存中における微生物の変化について検討した¹⁴⁾。

硫酸カルシウムを凝固剤として用いる場合は、pHは6.5～6.8となる場合が多いが、塩化マグネシウムを凝固剤として用いる場合は、pHは6.8～7.2となり、必然的に細菌も生育し易くなり、各種凝固剤を乾物含量として0.3%添加した材料を用いて、5℃で保存した場合、凝固剤として塩化マグネシウムを用いた場合は、硫酸カルシウムを用いた場合よりも細菌の生育が早いことが認められた。また液化豆腐は5~7℃で貯蔵した場合、2～3日後で集中的に発生する。

異臭は全く認められなかったが微生物により液化したものと考えられた。液化豆腐より2.4×10⁹/ｇのLeuconostoc mesenteroidesと8.2×10⁸/ｇのTrichosporon pullulansを検出した。これらの微生物が塩化マグネシウムの影響により著しく増殖したものと考えられる。塩化マグネシウムが微生物の生育に著しい影響を与えることが知られている。塩化マグネシウム又は硫酸カルシウムを凝固剤として用いて製造した豆腐に液化豆腐より分離したLeu.mesenteroidesとTr.pullulansを添加して豆腐の液化現象について検討を行った結果を表2に示した。

その結果、凝固剤として塩化マグネシウムを使用した場合、Leu.mesenteroides及びTr.pullulans を同時に添加したものは貯蔵2日後、Tr.pullulansのみ添加したものは貯蔵4日後で一部液化が生じ、Leu.mesenteroidesのみ添加したものは液化現象は生じなかった。また凝固剤として硫酸カルシウムを使用した場合、Leu.mesenteroides及びTr.pullulans を同時に添加したものは貯蔵6日後、Tr.pullulans のみ添加したものは貯蔵7日後で一部液化が生じ、Leu.mesenteroidesのみ添加したものは液化現象は生じなかった。

以上のことよりもめん豆腐の液化現象はTr.pullulans が主原因菌であり、Leu.mesenteroides、塩化マグネシウム、硫酸カルシウムがTr.pullulans の生育やプロテア－ゼ等の酵素の生産に影響を与えているものと考えられる。液化豆腐より分離したTr.pullulans の生育及びプロテア－ゼ生産に及ぼす塩類の影響について検討した結果、塩化マグネシウムの添加によりTr.pullulansの生育及びプロテア－ゼ生産が著しく増加した。

Tr.pullulansは工場の全ての落下菌及び空中浮遊菌から検出された。このため工場全体を殺菌するために工場の天井にオゾン発生装置を取り付け、夜間のみ5～8時間、オゾン濃度約0.5～3ppmで約6カ月作動させた。その結果、落下菌及び空中浮遊菌より検出されたTr.pullulansは約1/10に減少した。豆腐の液化現象が生じたのはまず最初にLeu.mesenteroidesが増殖してpH4.3まで低下した。その結果、豆腐の一般的な腐敗菌であるBacillusやMicrococcusの増殖が抑制され、その代わりにpH4.3でも増殖可能なTr.pullulansが生育し、豆腐の脂質及びたんぱく質を分解して、液化現象が生じたものと考えられる。Tr.pullulansは低温で増殖可能であり、脂質及びたんぱく質分解力を有する微生物であり、豆腐には極めて増殖し易い微生物である。

微生物のプロテア－ゼ等細胞外酵素の生産には塩類の影響が大きいと言われており、Katoら¹⁵⁾はPseudomonasのプロテア－ゼ生産は100％海水が一番よく、海水を薄めていくに従って低くなると報告しており、また東条ら¹⁶⁾はBacillusの場合、マグネシウムが生育にも、プロテア－ゼ生産にも著しい促進効果を持っていることを報告している。今回、液化豆腐原因菌であるTr.pullulansの場合も0.3％の塩化マグネシウムの添加により著しい生育の促進とプロテア－ゼ生産の増大が認められた。

通常、もめん豆腐は水晒し工程により、過剰な凝固剤を除去しているが、その除去効果が悪い場合はTr.pullulansの増殖が促進される可能性がある。この原因として大量生産に伴う水晒し工程の短縮化あるいは省略が挙げられる。実際には60℃の温水で5分間程度の処理を行うホットパックが普及しているので凝固剤の除去効率は極めて悪いと考えられる。もめん豆腐工場の床、側溝、機械には多くの乳酸菌、特にLeuconostoc mesenteroidesが付着しているので、オゾン水で殺菌すると効果がある^17),18)。

 

表2　液化豆腐より分離したTrichosporon pullulans (Tr.pullulans)及びLeuconostoc mesenteroides (Leu.mesen.)添加によるもめん豆腐保存中における液化現象の生成¹¹⁾

＋：一部液化、－：変化なし

接種菌数：Trichosporon pullulans1.5×10⁴/豆腐１丁

Leuconostoc mesenteroides　2.8×10⁶/豆腐1丁

凝固剤：塩化マグネシウム　0.3%

硫酸カルシウム　　0.3%

消泡剤：グリセリン脂肪酸エステル