ストレス応答とは、生物が外部からの刺激により、平常状態から逸脱し、その結果おこる合目的的な応答と著者は考えています⁽¹⁾。ただし、平常状態をどう定義するかは、TPOに依存します。北海道の人が、真冬にオーストラリアに出かけると、暑くてストレスを感じるかもしれません。逆にオーストラリアの人が冬に北海道に来れば寒冷ストレスとなり得ます。従って、平常状態から、逸脱効果を生物に与えたときにストレスが加わったと、著者は定義しています。この定義ですと、良い影響もストレスとしてしまうことになりますが、ストレスの善し悪しは見方によっては異なることもあります。このため、良いかもしれない影響もストレスとして考えています。また、ストレスを定義するよりも、平常状態を定義する方が難しいこともあります。このため、ストレスの状態を評価するときは必ず平常状態を定義しておき、その再現性を確認しておく必要があります^(2-4)。陰性対照の重要性です。また、より正確に評価する場合は陽性対照も必要です。毒性ストレスを評価するとしたら、類似の毒性物質と比較する必要があります。健康食品などでは、今評価している食品よりも効果のある食品や医薬品を陽性対照として評価する必要があります。
　我々はこれまで、多くの環境ストレスについて、そのストレスが生物に与える影響を評価してきました⁽⁵⁾（図1）。環境ストレスには、物理的ストレスとして、温度変化や高圧、放射線等、化学的なストレスでは、環境汚染物質やカビ毒等を挙げることができます。また、病原菌は生物的なストレス、疲労は社会的なストレスとして分類することができます。これらストレスについて、出芽酵母⁽⁶⁾を中心にメダカ⁽⁵⁾、マウス⁽⁷⁾、ブタ⁽⁸⁾、ヒト⁽⁹⁾、ヒト培養細胞⁽¹⁰⁾に対する影響評価を行っています。評価手法は、ストレスの負荷による、遺伝子発現量の変化、タンパク質発現量の変化、代謝物質量の変化について、網羅的に解析するところにポイントがあります。「網羅的に」とは、可能な限り多く解析するという意味です。遺伝子発現量については、代表的な生物種である、出芽酵母、マウス、ヒトを研究対象とする場合はDNAチップや次世代シーケンサーを使うことで、ほぼすべての遺伝子（数千から数万種類）について評価することが可能です。タンパク質では数百種類、代謝物質でも数百種類の量的な変化を観察することが可能です。ストレスを付加された生物は、そのストレスの影響を避けようとし、または、そのストレスによる傷害を修復しようとします。このような応答がストレス応答の中心になります。ストレス応答の結果、遺伝子の発現量、タンパク質の発現量、代謝物質量を変化させます。遺伝子、タンパク質、代謝物には機能があります。生物が合目的的にこれらストレスに応答していると仮定すると、変化した機能を評価することで、各ストレスがどのような影響を生物に与えているかを評価することができます。例えば、遺伝子の修復に関する機能を持つ遺伝子の発現やタンパク質が誘導されているとしたら、そのストレスにより、遺伝子に影響があった事が推定されます。逆に言うと、発ガン性物質や変異原性物質では遺伝子の修復に関する機能が誘導される事が推定されます。

図1　ストレス応答の網羅的解析

ストレス応答の評価は、ストレス付加前（標準状態・陰性対照）と付加後に、遺伝子発現量等を網羅的に測定し評価を行います。このとき、与えるストレスとその生物種により、与えられたストレスの意義が異なってきます（図2）。例えば、ガン細胞に、ある薬剤を与えます。この薬剤により、ガン細胞がストレスの結果死滅した場合、その死滅に至る原因を網羅的遺伝子発現解析で詳細に解析すると、抗ガン剤としての活用が期待される場合もあります。我々のグループでも、ある抗ガン効果を高める治療法の開発をしており^(7）、医師主導治験に入ろうとしています。ガン細胞に影響を与える物質や条件は、山のようにあります。ガン細胞に影響が有れば何でも抗ガン剤というわけではありません。そのメカニズムが明らかになり、初めて抗ガン剤として利用できる可能性が出てきます。同じように、ナノ粒子は抗ガン剤として利用できるという報告が多く出されていますが、残念ながら実験のミスによる結果がほとんどです。ストレス応答の詳しい生物学的な意義付けを網羅的に解析することで、実験ミスの原因が分かっています。ストレス応答を解析して、実験の際に気をつけなければいけないことが、これまでに多数報告されています⁽¹¹⁾。ナノ粒子の影響評価をする場合の正しい評価法については、現在では、網羅的な解析結果等を基にストレス応答の評価法が、国際標準機構で定められています⁽¹¹⁾。残念ながらこの標準を満足させる、ナノ粒子に関する毒性や抗ガン性の報告はほとんど無いのが現状です。ストレス応答を詳しく解析することで、実験の不備が見つかることはよくあることです。このように、ストレス応答を網羅的に解析することで、その実験の正当性や再現性についても議論することが可能であると考えています。
　ヒトに対する労働環境は各種ストレスが複雑に蓄積した現場でも有ります。飲酒などによる運転はもちろんですが、過労や、急性の疾患、多様なストレスに曝された場合の簡易な評価は、今後益々需要が伸びて来ることが想定されます。その上、より網羅的且つ簡便な方法が求められています。
　メダカ等の魚類は、水環境における生態影響評価を事前に評価しておく上で重要であり、平成十四年に、環境に放出する可能性のある一定量の物質については、メダカ等の水生生物を用いた影響評価が義務づけられています⁽³⁾。マウス、ブタ⁽⁴⁾等の実験動物に対する薬剤のストレスは、ヒトへの健康影響を模擬しておくという視点で数多く利用されています。我々が、口にする薬品の多くは、彼らの犠牲の上に成り立っています。動物に対するストレス応答の解析は、環境や健康影響を推定する上でなくてはならない技術となっています。

図2　網羅的ストレス応答解析の出口

これまでご紹介したストレスを受ける生物は、高等生物でした。微生物でもストレスを感知することはあります。微生物にとってのストレスは、人間からすると抗菌剤であり、食品などの保存法として利用できる可能性があります。我々は、これまでに、出芽酵母を用いて数百種類のストレスを微生物に付与し、その応答についても網羅的に観察してきました。このうち再現性が確認された50種類程度のストレス応答に関しては、網羅的な解析結果をGEO（Gene Expression Omnibus）に登録しています⁽¹²⁾。
　繰り返しになりますが、酵母細胞に対する化学的なストレスは殺菌剤としての可能性があります。酵母に対する物理的なストレスは殺菌処理としての利用が期待できます。化学的なストレスとしては、これまで、カビ毒、テルペン類、ガス圧、ナノ粒子、環境汚染試料などを酵母細胞に与え、その影響を評価してきました。一部のカビ毒は遺伝子に関する修復系が誘導されるため、変異原性が疑われ、抗菌剤というよりは有害物質として扱われます⁽¹³⁾。ただしカビ毒の一部は、抗生物質でもあり、既に医学分野で利用されている物質もあります⁽¹⁴⁾。テルペン類や、ガス圧、一部のナノ粒子は殺菌効果が認められますが、特に顕著な有害性は認められていません。物理的なストレスとしては、高温、高圧、低温、放射線等を挙げることができます⁽¹⁾。放射線を受けた酵母は遺伝子修復応答を示しますが⁽¹⁵⁾、放射線が残るわけではないので、殺菌技術としては当然使えます。

殺菌技術として最も普及しているのは熱殺菌技術です。120度の殺菌技術は今でもこれに勝てる簡易な技術は開発されていません。
　この他、伝統的に使われているヨードは殺菌剤として有効です。ストレス応答として観察すると、応答の初期の頃はタンパク質の代謝に関与する遺伝子の誘導が顕著であり、遅れてエネルギーの生産に関与する遺伝子が誘導されてきます。ストレスの初期の段階ではヨウ素が酸化的にタンパク質を変性させ、変性したタンパク質の代謝機能が誘導される結果と考えられます⁽¹⁶⁾。この応答は、農薬類やカビ毒の応答に似ていますが、遺伝子の修復に関与する機能の誘導がありません。農薬類やカビ毒に比べると変異原性が低いものと理解できます。
　銀の抗菌性はよく知られています。人類の歴史と共に食器として使われてきた金属です。安全性という点では信頼性があり、抗菌性があるため、殺菌剤としての利用が可能です。実際に、ガラスの抗菌剤や、医療分野ではカテーテルに抗菌性を持たせるために利用されています⁽¹⁷⁾。また、銀ナノ粒子には抗菌性があることは既に確認されています⁽¹⁸⁾。ただし、この抗菌性は、銀ナノ粒子から溶解してくる銀イオンによるものと考えられます。多くの論文では、銀イオンが検出できないため、殺菌剤の本体を銀ナノ粒子と考えています。しかし、銀ナノ粒子から遊離する銀イオンは反応性が高く、さらに、ナノ粒子を取り除くためのメンブレンフィルターに結合するため、銀イオンは検出できません（未発表）。銀イオンの溶解性を評価するには、純水中で、遠心器を用いてナノ粒子を系から除かないと、イオンとして補足するのは難しいからです。この結果、銀ナノ粒子は抗菌性があるということになっています。銀ナノ粒子が抗菌性を示す原因が銀イオンである限り、銀ナノ粒子を利用する必要はありません。銀粒子や銀イオンで充分殺菌性を発揮します。

静水圧も熱と同様に殺菌技術として利用することは可能です。180MPa、0度では、昇圧後すぐに降圧しても、60%程度まで生菌数が低下します。この状態からの細胞の修復を1時間程度の回復培養条件で観察すると、ユビキチン-プロテアソーム系、Hsp104等のタンパク質代謝に関わる遺伝子が誘導されました⁽¹⁹⁾。メタボロミクスによる評価では、グリシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン等の膜貫通型タンパク質の膜貫通ドメインを構成する主要なアミノ酸が有意に蓄積されていました⁽²⁰⁾。これらの結果は、酵母の死につながる高圧損傷は細胞膜構造をターゲットとする損傷であること、およびその損傷からの膜タンパク質代謝を中心とする修復過程の重要性を示しています。著者はこの分野の研究を30年程基礎研究として続けており、ようやく、なぜ高圧で微生物が死ぬのかという課題の解決の糸口が見えてきたところです。

ビールやコーラの炭酸ガス圧、数気圧程度でも殺菌効果が期待できます。我々は、微高圧炭酸ガス圧殺菌技術と呼んでいます⁽²¹⁾。微高圧炭酸ガス殺菌技術はpHの低下に従って、殺菌効果が飛躍的に高まっていく特徴があります。低いpHでは、炭酸イオンが炭酸分子になり、炭酸分子としての細胞阻害が高まるためと推定されています。よく炭酸イオンによるpHの低下効果が原因では、という意見を頂きますが、化学的には正しくありません。果汁のpHは3.5以下が多い事が知られていますので、果汁の殺菌に適した技術であるということができます。微高圧炭酸ガス圧殺菌の最も特徴的な点はその高温依存性にあります。微高圧殺菌技術は高温殺菌の効果を高めることができるからです。酵母を指標微生物として、少し強めの炭酸ガス圧力、5MPa程度で、25度程度に温度を上げると、40度程度の熱効果に相当する殺菌効果が観察されます。50度にまで上げると、ほぼ生菌数はなくなってしまいます。通常酵母にとって30度はちょうど良い生育温度です。
　微高圧炭酸ガス圧ストレスのゲノミクスによる遺伝子発現解析では、0.5 MPa炭酸ガス、30度、2時間処理された酵母を対象に解析しました。この程度のストレスでは50％程度の生育阻害を示します。50％の生育阻害は、網羅的な遺伝子発現解析の標準的な条件として、他の多くのストレス付加にも利用しています。微高圧炭酸ガス処理により誘導された遺伝子は、2倍以上誘導で507遺伝子、4倍以上誘導で67遺伝子でした。これらを機能解析したところ、2倍以上誘導では、アルギニン代謝、尿素サイクル等の代謝系、鉄イオンの輸送、イオンの輸送など細胞膜トランスポーター系、熱ショック応答によるストレス応答系、熱感作反応、グルタチオン関連、過酸化反応などの解毒系、等の機能群が顕著に誘導されていました。4倍以上誘導では、上記の内、尿素サイクル、イオンの輸送系が残り、これら機能が顕著に誘導されている可能性を示していました。2倍以上誘導遺伝子産物の細胞内局在を解析したところ、液胞、細胞膜に局在する遺伝子産物をコードする遺伝子の誘導が顕著でした。特に液胞に局在する因子をコードする遺伝子の誘導が顕著でした。誘導された遺伝子のリストを解析すると、上位に位置する遺伝子のほとんどが、細胞膜に局在する鉄イオン輸送に関与する遺伝子でした。また、界面活性剤などのように細胞膜に影響を与えると誘導される遺伝子マーカーとして知られる、INO1とOPI3（細胞膜成分の生合成に重要な遺伝子）の誘導が顕著でした。以上を総合すると、液胞を中心として細胞膜に、大きな影響を与えていることが推定されました⁽²²⁾。
　微高圧炭酸ガス圧殺菌技術は、殺菌目的よりも静菌目的の方が有効に利用できるのではないかとも考えています。ビール、パン、果糖ブドウ糖液糖等の酵素反応を利用する食品は、微生物汚染を防ぐために、高温条件に限定して酵素反応を利用しています。化学物質を利用しないため、安全ですが、高いエネルギー消費と耐熱性酵素が必須であるという点で限界があります。静水圧を用いても、50MPaで静菌が可能になりますが、大きな装置が必要で、多大な投資が必要になります。微高圧炭酸ガス圧技術を用いる場合は、反応容器に多少の耐圧性を付与するだけで静菌条件を設定できます。容器の耐圧化がむつかしい場合は、ガス管の様な配管を長くして、容積の確保や連続反応も可能になります。何よりも、食品工業に利用される酵素の至適pHは酸性側にあります。

本誌では、酵母のストレス応答機構を解明することで、新しい殺菌、及び静菌技術開発が可能になることを紹介させて頂きました。ストレスと言うと悪い印象を持たれる方も多いかとは思います。しかしながら、見方を変えるだけで、抗ガン剤の開発、殺菌剤の開発、健康影響評価等様々な出口があることを理解していただけたら本誌の意味があると思っています。まだまだ出口はあるはずです。アイデアがありましたらお知らせ下さい。

1　 岩橋 均: 環境ストレス応答の主役達　低温生物工学会誌 52: 55-59, 2006

2　 Mizukami, S., Suzuki, Y., Kitagawa, E., Iwahashi, H.: Standardization of cDNA microarray technology for toxicogenomics; essential data for initiating cDNA microarray studies. Chem-Bio Info. J. 4: 38-55, 2004.

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9　 原田暢善, 岩木 直, 岩橋 均: 連続的疲労負荷過程における血液中で発現する生理的疲労関連遺伝子の検討. 第6回日本疲労学会, 2010（大阪）

10　Takahashi J., Misawa, M., Iwahashi, H. Gene expression profiling can predict the fate of HeLa cells exposed to X-ray irradiation with or without protoporphyrin accumulation Genomics Data, 5, 192–194, 2015

11　ISO/TC229/TS19337; Nanotechnologies － Characteristics of working suspensions of nano-objects for in vitro assays to evaluate inherent nano-object toxicity

12　Iwahashi, H. Pressure-Dependent Gene Activation in Yeast Cells High Pressure Bioscience and Biotechnology, Akasaka K. and Matuki, H eds Springer

13　Iwahashi, H., Kitagawa, E., Suzuki, Y., Ueda, Y., Ishizawa, Y., Nobumasa, H., Kuboki, Y., Hosoda, H. and Iwahashi, Y.: Evaluation of toxicity of the mycotoxin citrinin using yeast ORF DNA microarray and oligo DNA microarray. BMC Genomics 8: 95,2007.

14　岩橋　均，重松　亨:「暮らしに役立つバイオサイエンス」放送大学教育振興会刊

15　岩橋　均: マイクロアレイを用いた環境ストレスの影響評価. 地球環境と放射線：生態系への影響を考える 村松康行編. 研成社（東京）, pp. 151-161, 2003.

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18　大橋 静江, 山本 宏治, 銀を含有するシリカガラスの抗菌性，歯科材料・器械 16: 241-248, 1997

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21　原田暢善, 岩橋 均, 大淵 薫, 田村勝弘: 中国産クコ果汁に対する二酸化炭素ガス微高圧長期処理 「高圧バイオサイエンスとバイオテクノロジー」 pp96-100, 2008.

22　松岡寛之, 栗林 努, 鈴木福英, 岩橋 均, 荒尾敏明, 鈴木良尚, 田村勝弘: 酵母DNAマイクロアレイを用いた二酸化炭素の影響評価　「高圧力下の生物科学」　金品昌志、田村勝弘、林力丸　編集、さんえい出版 pp 193-200, 2006.

岩橋　均(イワハシ　ヒトシ)
岐阜大学　応用生物科学部　教授

略歴
和歌山県和歌山市出身
昭和52年　北海道大学
昭和61年　北海道大学大学院農学研究科博士課程終了（農学博士）
昭和61年　通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
平成03年　通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
平成13年　独立行政法人産業技術総合研究所
平成23年　岐阜大学応用生物科学部応用生命科学課程応用微生物学研究室　教授
　　　　　　　現在に至る

兼務
NPO法人岐阜大学環境技術研究会理事
有限会社ピエゾフーズテクノ東アジア取締役
産業技術総合研究所招聘研究員
ISO/TC229　ナノテクノロジー国内審議会　委員
放送大学客員教授