少し変わった表題であるが、これは10年あまり前に筆者が「かきのノロウイルス汚染」と題する総説^１）を書いたことに関係している。この総説を書いた理由は、大きく２つある。１つは、筆者がかき類を中心とした二枚貝の研究者でありながら、二枚貝（特にかき）の喫食による食中毒が問題とされていたノロウイルスに関する知識が乏しく勉強する必要があったことである。もう１つは、かきは重要な水産物であるにもかかわらず、それまでのかきとノロウイルスとの関係についての研究は、ほとんどが公衆衛生分野や感染防御分野の研究者によるものであり、水産分野の研究者によるものは少なかったことである。文献を網羅し、かつ整理することによって自分も含めた水産分野の研究者が取り組むべき課題が見えてくると考え、まとめることにした。その結果、当初思っていた以上にノロウイルスはかき養殖にとって厄介であると考えられた。また、思っていた以上に明らかとなっていないことが多く、取り組むべき問題も数多く見つかった。少しずつでも明らかにしていこうと研究をはじめた矢先、2006年のノロウイルス胃腸炎の大流行とそれに伴うかきの風評被害が起きてしまった。公衆衛生と水産双方のメンバーが加わった研究プロジェクトが組まれ、筆者も微力ながら参画し、研究を行った。結果をみると、新しい知見が得られたりしたものの、ノロウイルス問題の解決には至らなかった。特にかき養殖やかきの販売で問題となる点の解明、すなわち「かきがノロウイルスを取り込むしくみ」と「かき体内からのノロウイルスの除去」に関する研究は、なかなか進まなかった。本稿では、以前の総説の「その後の10年間」で報告された研究の中から、特に上記の２つの問題に関連した重要な事柄である「ノロウイルスは海水中にどんな形で存在し、かきによってどのように捉えられるか」と「ノロウイルスはかきの体内で、どのように保持されているか」について筆者なりの解説を試みる。なお、本稿で取り扱う「かき」であるが、日本では一般的に漢字では牡蠣と表し、標準和名をマガキ、学名をCrassostrea gigasという種を指すことが多い。しかし、国内にはイワガキをはじめ別の種がいるし、海外にも食用とされる別種がいくつもある。そこで、ここではノロウイルスとの関係が問題となる食用の牡蠣類全般を「かき」と呼ぶことにしたい。

　　　　：海水中でのノロウイルスの動態および安定性はどうか？

　大変よく知られていることなので詳しい説明は省略するが、ノロウイルスには多くの型がある。ヒトに感染するノロウイルスは、主に遺伝子グループIとII（GIとGII）の２つであり、それぞれのグループに遺伝子配列などが少し異なる型（遺伝子型）が存在する。現在では、34（以上）の遺伝子型があるとされている^２）。すなわち、ノロウイルスはとても多様性に富んでいるわけで、環境中での振る舞いやかきとの関わり方が遺伝子グループによって、あるいは遺伝子型によって異なっている可能性は十分考えられる。
　ノロウイルスは、下水処理施設によって多くは除去・不活化されるが、それは完全とはいかず、施設からの排水を通して海に入るものがある。そして、除去や不活化のされやすさ・されにくさに、遺伝子グループの違いが関係していると考えられる結果が報告されている。いくつかの研究で一致していることとしては、（１）夏場はGIがGIIよりも多く存在し、除去されずに残る数も多い。（２）冬場は逆にGIIが多くなる。（３）下水中での安定性はGIの方が高い^{３）、４）}。これらのことは、沿岸の海水中に多様な型のノロウイルスが存在することを示し、また沿岸で養殖されるかき類から複数の型のノロウイルスが検出される事実とよく一致する。また、安定性に関しては、これらのウイルスが感染性をどの程度保持しているのかは明らかではないが、少なくともRT-PCRで検出可能なレベルを保っているとはいえる。上では簡単に述べたのだが、ここで非常に重要なこととして「ある時点で採取されたかき類から複数の型のノロウイルスが検出される事実」がある。つまり、かき類は、存在する時期も濃度も異なる色々な型のノロウイルスを取り込み、それをある程度の期間にわたって蓄積・保持していると解釈できるのである。一見、普通のことに思えるかもしれないが、着目すべきポイントが少なくとも２つある。１つは、ノロウイルスは、かきに取り込まれることが可能な形態で海水中に存在しているのだということ、もう１つは、ノロウイルスは、かきの体内に一定期間以上長く留まり、検出可能な状態でいることができるのだということである。それでは、どんな形で存在するのか？なぜ長く留まれるのか？以下の項目でこれらの問題を考察したい。

　　　　：ノロウイルスは海水中でどのような形で存在するか？

　従来、この問いに対する答えは比較的簡単だと考えられてきた。すなわち、多くのノロウイルスはかきの消化盲嚢（中腸腺とも呼ばれる、胃を取り囲む消化のための補助器官である）に局在しているから、餌料とともに取り込まれ、蓄積されるのであろうとする見解である。以前の総説でもそのようにまとめた^１）。筆者は、基本的にはこれが最も理に適っていると現在でも考えている。しかし、ノロウイルスの多様性を考慮した時、海水中でのノロウイルスの存在様式は一様だと決めつけてよいのだろうか？また、季節や水温によって存在様式は変化しないのだろうか？餌料とともに取り込まれるのなら、ノロウイルスは餌料に付着しているのだろうか、そのしくみはどんなものだろうか？このように、様々な疑問が出てくることも確かである。いずれにせよ、10年前には明確な解答はなかった。
　 2009年に米国で発表された論文に、１つの解答が示された^５）。毎月様々な目合のフィルターで海水を濾過し、捕捉されたノロウイルスを検出したところ、ノロウイルスは、プランクトンに相当する大きさの粒子と結合しているケースもあるが、ノロウイルスのみで海水中に存在するものも相当あると考えられる結果が得られたというものである。加えて、こうしたノロウイルスの存在様式の違いには、ウイルスの型や季節などが関係している可能性が示された。同じ日に採取された場合でも、水に浮遊しているノロウイルスと粒子に結合しているノロウイルスは、同じGIでも違う遺伝子型であった。これはとても重要な報告である。ただし、この論文ではほぼGIしか検出されておらず、GIIはどういう様式をとるのかなど、明らかではない点が多い。この論文は、その後の51論文に引用されているが（Google Scholarによる）、米国における環境水からのノロウイルスの検出例としての引用ばかりで、同様の調査をした研究はない。研究例をさらに積み上げて、ノロウイルスの存在様式を明らかにすることが必要である。
　かきは鰓の繊毛により餌となる粒子を捕捉するが、捕捉できる最小の大きさは直径100 nm、すなわち100/1,000,000 mmである。流速を考慮すると、実際はもう少し大きい粒子でないと捕捉できないと考えられる。ノロウイルスの粒子は40 nm前後と大変小さく、単独ではかきの鰓を素通りしてしまうはずである。そこで、何かの浮遊有機物と結合して大きな塊となり、かきの鰓に捕捉されて餌料として取り込まれるのだろうという推測が支持されてきた。しかし、先の論文では、単独で浮遊するノロウイルスと同じ遺伝子型（粒子に結合しているものとは異なる型）が、かきからも検出されている。すなわち、鰓繊毛による物理的な捕捉だけではないしくみを考える必要が出てくる。次項で、そのことを考察する。

この課題を明らかにするためには、項目１で見たように、ノロウイルスはかきの体内にある程度長く留まることができると推測されることや、項目２で見たように、ノロウイルスを捉えるには物理的な捕捉だけではないしくみがあると考えられることに対する答えを得ることが鍵となる。
　2003年に、ノロウイルスはヒトの血液型抗原と特異的に結合することが示され、感染のしくみを解く第一歩になると期待された^６）。すべてのヒトではないが、感染部位である小腸の上皮細胞にも血液型抗原は発現しているからである。そして2006年になって、かきの消化盲嚢部にある盲嚢細管の消化細胞表面に、ヒトのＡ型抗原によく似た糖鎖が存在し、これとノロウイルスが特異的に結合していることが報告された^７）。同様の観察結果は、他の研究者からもほとんど同時に示された^８）。この論文におけるさらに重要な発見は、ノロウイルス陽性反応が胃の周辺結合組織にある血球の中にも認められたことである。これは、ノロウイルスが消化管の表面から血球へと移行し、体の奥深くに運ばれていることを示している。血球へ移行するしくみの全容はまだ明らかではないが、この現象はノロウイルス除去の困難さと深く関連していると考えられるし、項目１で示されたノロウイルスがかきの体内に一定期間以上留まれる理由かも知れない。さらに、遺伝子型の違いによってかき体内に蓄積される効率も大きく変わることがわかった^９）。Norwalk virusとして初めて特定されたノロウイルスであるGI.1型は、GIIに属する型のノロウイルスに比べて短時間で高率に蓄積される。このことは、GIIに比べてあまり地上では流行しないGIのノロウイルスが、かきからは高頻度で検出される理由であるとも考えられる。
　さらに、ノロウイルスは、遺伝子型によって異なる組織結合性を示すことが明らかとなってきた^{10）、11）}。例えば、高い病原性を示し、日本における2006年の大流行を引き起こしたことで知られるGII.4型は、消化盲嚢よりも鰓や外套膜の繊毛に多く結合する。逆に、GI.1型は、消化盲嚢で高い結合が認められる。この違いは、それぞれのノロウイルスが高い親和性を示す血液型抗原（糖鎖）が異なっていることに起因する。GII.4型は、シアル酸という糖を含む、Ａ型抗原とは異なる糖鎖に特異的に結合する。かき組織へのノロウイルスの結合についてすべてが明らかとなったわけではないが、糖鎖構造を介した特異的なものであることが示された意義は大きい。項目２で挙げた鰓における捕捉のしくみも、糖鎖による化学的な結合を想定すれば、ある程度説明がつくと思われる。海水中にフリーの状態で存在しても、鰓の細胞と結合することで事実上濃縮されている可能性は十分にあると言える。

これまで国内外で行われた立派な研究を紹介する形で、はじめに挙げた２つのポイント、すなわち「ノロウイルスは海水中にどんな形で存在し、かきによってどのように捉えられるか」と「ノロウイルスはかきの体内で、どのように保持されているか」について解説してきた。筆者が特に２つのポイントを挙げたのは、これらを本当に明らかにできれば「かきがノロウイルスを捕捉しないような手段」を講じ、「たとえ取り込まれたとしても体内に留まらないよう」にして、かきとノロウイルスの問題を解決できるからである。「言うは易く行うは難し」であることはもちろん理解している。しかし現在のところ、筆者はいろいろな事柄を一生懸命に考えた上で、たとえ非常に困難であってもこの方向に進む以外はないとの結論に至っているのである。
　それでは、先に挙げた２つのポイントはどの程度明らかになったのであろうか？結論から言えば、基礎研究の部分だけみてもまだ不十分である。かきの研究者である筆者を含めてまだまだ取り組まなければならない課題がある。本項では、２、３の点を挙げてみる。
　最初の「ノロウイルスの存在様式」については、項目２の本文中でも触れたように、研究事例が少なすぎて不明な点が残されている。例えば、引用した論文^５）では、調査年の３月にのみ、大きな粒子画分（200 µm以上）において高濃度のノロウイルスが検出されている。著者は、プランクトンを大きさで分類しており、このサイズは動物プランクトンの画分になるが、動物プランクトンがノロウイルスと関係するかどうかは明らかではない。著者も何か他の粒子に吸着していると推論しているが、何なのかについての記載はない。ノロウイルスとプランクトンの付着は、他の海域でも同程度なのか、あるいは季節性はあるのか、また単独で浮遊するノロウイルスはどれくらいの割合で存在し、安定性はどの程度なのかなど、しっかりとした研究を行うことが本当に重要である。
　次の「かき体内でのノロウイルスの保持様式」については、かなりのことが明らかになってきたと思われる。しかし、詳細にみれば不明確な点がいくつもある。ここでは、ノロウイルスが付着するかき細胞の表面糖鎖について、必要な研究を指摘したい。
　これまでの研究で明らかになっているのは、血液型抗原に類似の表面糖鎖がかきの組織でみられ、ノロウイルスと結合していることである。まず、「類似」について、明確にする必要がある。抗体との反応性は、全く同一の分子でなくても認められることは広く知られている。かきの組織・細胞の場合も、血液型抗原と全く同じ分子が存在するわけではなく、抗原となる表面糖鎖に共通する構造を持つ分子が存在すると考えるのが実際的だろう。そして、かきの細胞におけるノロウイルス結合分子そのものを特定し、構造を明らかにすることが絶対に必要である。
　次に、このかき細胞の表面糖鎖の本来の役割を知ることである。これらは、もともとノロウイルスを結合するために細胞表面に存在しているのではなく、本来の機能があると考えるべきである。例えば、これらの表面糖鎖はノロウイルスと結合するように、１種の受容体として機能しているならば、かきが持つ本当のリガンドが存在することになる。この点を明らかにするのも基礎研究としては重要である。
　現在、筆者は予備的な実験段階であるが、レクチンという糖鎖を特異的に認識するタンパクで鰓組織にある表面糖鎖を塞いだ時に、ノロウイルス中空粒子（VLP）の結合性がどう変化するかを調べている。ノロウイルスの取り込みを減らすには、ノロウイルスと鰓の組織とを結合できなくすることが有効であり、そのためには糖鎖を塞いでしまおうという考え方である。まだin vitroの実験のみであり、完全な抑制はできないが結合を減らすことはできている。しかし、この表面糖鎖が、かきの生理において重要な役割を担う受容体であるならば、これを塞ぐことは問題となるため、本当の役割を明らかにしたいと考えている。

「かきとノロウイルス」の関係について、ポイントを絞って解説した。10年よりも少し前に、ノロウイルスのことを調べるきっかけの１つとなった筆者にとって忘れられない事柄がある。それは、宮城県保健環境センターの秋山和夫部長（当時）をはじめとする方々が筆者の研究室に来訪された時のことである。目的は、投稿予定の原稿の中で記したネコカリシウイルス（ノロウイルスの代替ウイルス）を取り込ませたかきの組織に関連して、細胞の見方や名称に誤りなどがないかを確認するためであった。この時の原稿は後に論文として発表されている^12）。消化盲嚢を中心とした組織の写真を見ながら少し説明を加えさせていただいたのだが、その中にあったin situ hybridizationの写真がとても気になった。それは、消化盲嚢から少し離れた結合組織に存在する血球が陽性反応を示しているものであり、筆者はそうした像を初めて見たのである。過去に報告されていたPCRの結果から考えて、消化盲嚢を構成する細胞に陽性が認められることは尤もだと思ったが、結合組織の奥深くにある血球もノロウイルスを取り込んでいることを初めて知ったのである。これでは簡単に除去はできないのではないか、とても厄介なものではないかと思ったことを今でもはっきり記憶している。そして約１年後に、ノロウイルスVLPを用いた研究で、盲嚢細管の消化細胞がノロウイルスと特異的に結合していることと消化盲嚢周囲の血球が取り込んでいることを示す論文が発表された^７）。現在では、血球がノロウイルスの取り込みに関与することは間違いないと考えられている。かきでは、組織常在型の血球、特に消化管周囲の血球は栄養成分の輸送の一端を担うと考えられる。おそらくノロウイルスは栄養成分と一緒に取り込まれているのであろう。このような、かきにとっての自然な生理機能が、結果としてノロウイルスの取り込みにつながり、そして排除を難しくしている可能性は否めない。すなわち、ノロウイルスを排除するためにはかきの生理現象、つまり自然の流れに逆らわねばならないことが必ず出てくる。もちろん、希望は持っているが、ノロウイルスフリーのかきを生産するための戦いは厳しいものだと言わざるを得ない。

1)　 室賀清邦・高橋計介：かきのノロウイルス汚染.日本水産学会誌、71、535-541、2006.

2)　 Vinje J: Advances in laboratory methods for detection and typing of norovirus. J. Clin.Microbiol., 53, 373-381, 2015.

3)　 Nordgren J et al.: Prevalence of norovirus and factors influencing virus concentrations during one year in a full-scale wastewater treatment plant. Water Res., 43, 1117-1125, 2009.

4)　 Kishida N et al.: One –year weekly survey of norovirus and enteric adenoviruses in the Tone River water in Tokyo metropolitan area, Japan. Water Res., 46, 2905-2910, 2012.

5)　 Gentry J et al.: Norovirus distribution within an estuarine environment. Appl. Environ. Microbiol., 75, 5474-5480, 2009.

6)　 Tan M and Jiang X: Norovirus–host interaction: multi-selections by human histo-blood group antigens. Trends Microbiol.,19, 382-388, 2011.

7)　 Le Guyader FS et al.: Norwalk virus-specific binding to oyster digestive tissues. Emerg. Infect. Dis., 12, 931-936, 2006.

8)　 Tian P et al.: Norovirus binds to blood group A-like antigens in oyster gastrointestinal cells. Lett. Appl. Microbiol., 43, 645-651, 2006.

9)　 Maalouf H et al.: Strain-dependent norovirus bioaccumulation in oysters. Appl. Environ. Microbiol., 77, 3189-3196, 2011.

10)　Maalouf H et al.: Distribution in tissue and seasonal variation of norovirus genogroup I and II ligands in oysters. Appl. Environ. Microbiol., 76, 5621-5630, 2010.

11)　Le Guyader FS et al.: Transmission of viruses through shellfish: when specific ligands come into play. Curr. Opin. Virol., 2, 103-110, 2012.

12)　山木紀彦ら：in situ hybridization法によるカキ消化盲嚢部の組織化学的ウイルス分布.日食微誌、23、21-26、2006.