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食品工場の微生物制御へのオゾン利用技術
食品・微生物研究所 所長 内藤茂三

1.はじめに

スープ類、タレ類、佃煮類は食塩や糖類を添加して浸透圧を高めて保存性を確保しているが、最近の低塩、低糖化傾向により保存性が低下し、容器の膨張や製品の液化、酸敗等の異常が発生し、クレーム品となる事例が多発している。これらの原因となる微生物は工場の製造ラインから混入した乳酸菌や酵母である。特に酵母は植物性原材料や糖類を使用する食品に良好に生育し、保存料として使用した酢酸、乳酸、クエン酸等の有機酸を資化する。その結果、食品のpHが高くなり、細菌が増殖して変敗する場合もある。一方ある種の酵母においてはクエン酸回路が存在し、これが糖の好気的代謝の主流をなしている。ブドウ糖からクエン酸を生産してこれを菌体外に生産して食品中に蓄積する酵母としてSaccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Hansenula, Candida, Torulopsis, Trichosporon等がある。酵母や乳酸菌は保存料や殺菌剤に対して抵抗力のあるものが多い。例えばRhodotorulaに属する数種の酵母は0.25%の安息香酸を炭素源としてpH4.5でもよく生育し、Saccharomyces roseiは0.25%のプロピオン酸(pH4.5)、Brettanomyces intermediaは0.1%のソルビン酸存在下で良好に生育する。保存料等で酵母や乳酸菌の増殖を阻止することは困難である。そこで最近、これらの酵母や乳酸菌に極めて即効性がある食品添加物としてオゾンが注目を浴びてきており、多くの企業の採用されている。わが国においては古くからオゾンは製造用剤として既存食品添加物リストに記載されて、食品及びその製造に利用されてきたが、アメリカにおいては2000年8月に食品添加物として食品及びその製造、貯蔵にオゾンを使用することについて米国食品医薬品局(FDA)より認可を受け、2001年6月26日に公布された。このため、オゾンは世界中に残留しない安全な食品添加物として益々利用が進んでいる。

2.オゾンの特徴

オゾンは、酸素原子3個で構成される分子であり、酸素の同素体である。オゾンは反磁性で1.287オングストロームの酸素―酸素結合を有し、4つの共鳴構造で示される。このことからオゾンは両性イオンである。酸素原子は8個の電子を持っているが、そのうち2つは酸素原子に強く結合されている。二本のσ結合に4個の電子が使用されるので、オゾンの性質は残り14個の電子の骨格構造で決定される。オゾンの電子構造IとUに2本の結合が、そのうち1本はσ結合であるが、もう1本はπ結合である。このπ結合の電子はσ結合のように特定の結合に束縛されていない。分子の対称性から構造TとUが同じ確率で生成する。またこの孤立電子対は原子の近くに分布する。
このため原子が+又は−に荷電している状態になり電気双極子を持ち得る。ここに示した4つの分布はエネルギー的にみて比較的安定な分布である。オゾン分子は主としてこれらの4つがある確率で混ざりあったものと考えられる。このように電子の分布が明らかに異なったものが混合しているため種々の科学的性質を示すものと考えられる。
オゾンは不安定であり、その半減期は乾燥空気中で12時間以上、水に溶けると不安定となり蒸留水(20℃)で165分である。このようにオゾンは気相中でも自然に分解されて酸素分子になる。オゾンの酸化還元電位は表1に示すように自然界ではフッ素に次いで高く、2.07Vとなっている。このためオゾンは極めて強い酸化力を示す。
表1 酸化剤の酸化還元電位
オゾンは、常温では無色の気体であるが、-119.9℃で液化、暗青色の液体となる。また、-193℃で暗紫色の固体となる。酸素は、紫外線領域(200〜300nm)に吸収を持たないが、オゾンは200〜300nmにHartly bandと呼ばれる吸収体を有し、ガス状オゾンで253.7nm、水溶液中のオゾンで260nmに、吸収最大値を示す。オゾンの水に対する溶解度は、一般に、気液平衡状態下における溶液中のオゾン濃度と気体中のオゾン濃度の比である気液分配係数(D)を用いて表される。

オゾンはその、同素体である酸素に比べ、水に対する溶解度が大である(20℃での水に対する気液分配係数は0.0333)。オゾン及び酸素の水への溶解度を表2に示す。
オゾンの水に対する溶解は、ヘンリーの法則に従う。従って、温度の上昇に伴い、D値は小さくなり、溶解量は減少する傾向にある。オゾンの水に対する気液分配係数値については、いくつかの報告があり、その値はおよそ0.20〜0.30である。
表2 水に対する空気、酸素、オゾンのヘンリー定数 E=atm/モル分率

3.オゾンの生物への影響

(1)オゾンガス

オゾンの呼吸器系統に対する作用は多面的かつ有害で特に急性的には喘息発作、呼吸器の損傷、頭痛を引き起こす。オゾン吸入による呼吸器の損傷、ときには生体に重大な結果をもたらすこともある。その損傷は高濃度オゾンによる肺の直接破壊作用と、肺の病原体に対する防御機構の破綻による二次的な感染症がある。低濃度でも喘息患者や気道過敏症の高い者にとっては呼吸器の著しい低下や角膜障害、頭痛をもたらすことがあるので注意する必要がある。急性毒性は気管及び気管支、鼻咽喉、肺胞等の呼吸器機能の低下が中心である。その他のオゾンの作用は、赤血球の球状化という二次的反応で出現する。これはオゾンによるフリーラジカルの生成、過酸化脂質形成に基づく。また慢性毒性は、気道損傷、肺細胞の損傷、頭痛、眼痛、不眠症、風邪、集中力欠損等の形で現れる。なおこれらの現象が現れたらすぐオゾンとの接触を断つことにより回復する場合が多い。オゾン濃度測定器に関しては国や業界の基準がほとんどないまま現在に至っている状況から、種種の問題を生じている。このため気中オゾンの利用については、残存オゾンの分解システム、完全な封鎖システム、作業環境の排気システム、オゾン濃度管理システムが必要である。

(2)オゾン水

オゾンは分子状のオゾンの形で水中に溶解し、脱色、殺菌、有機物の分解等を行い、この反応で消費されずに残ったオゾンは比較的速やかに酸素分子を自己消化するもので、残留性は少ないという特徴を持っている。オゾン水の生成はpH、水温、有機物や無機物の濃度により著しく異なる。オゾン水の半減期は比較的短いが水温、有機物及び無機物の種類と量、pHによって著しく異なる。

4.オゾンの殺菌機構

細菌の殺菌を塩素によって行った場合、塩素は細菌の細胞壁を通過し、酵素が損傷を受けて死滅する。またメチシリンに代表されるβ―ラクタム系の抗生物質による殺菌は、細胞壁合成酵素の活性部位にこの抗生物質が結合して、細胞壁合成を停止させるという機能的破壊である。すなわちワンポイント攻撃である。オゾン殺菌ではオゾンは細菌の細胞壁を構造的に破壊する。すなわちオゾンが細菌の細胞壁を構造的に破壊し、あるいは分解することによって酵素の活性が失われ、濃度高ければ中に侵入し、核酸を破壊する。いわゆるマルチポイント攻撃であるということができる。
中性域における溶存オゾンの主たる反応形式は分子状オゾンの反応である。このため細胞壁や細胞膜の構成成分である脂質との反応が生じる。まずオゾンは不飽和結合に反応し、生成した過酸化物フリーラジカルの生成が始まり、さらに連鎖反応が始まる。同時に細胞壁や細胞膜の構成成分であるたんぱく質にも反応が生じる。オゾンとたんぱく質との反応を考える場合は、具体的にはオゾン易反応性のアミノ酸残基との反応を意味する。
さらにオゾン負荷量が多いと易反応性の官能基を求めて中に侵入して反応する。特にグアニンやチミンの反応性が高い。以上のことを要約すると、細菌や真菌の場合は、オゾンの作用を最初に受けるのは細胞表層等の諸成分であり、細胞膜及び細胞膜構成成分のたんぱく質の分解及び不飽和脂肪酸残基の酸化による不活化などがオゾンの殺菌機構であると考えられる。ウイルスのオゾンによる不活化は主としてRNAあるいはDNAの破解、たんぱく質コートの損傷によると考えられる。

5.食品変敗微生物のオゾン殺菌に影響を与える因子

オゾンガス殺菌

(1)湿度(RH関係湿度)
オゾンガス殺菌に最も影響を与えるのは湿度である。一般的に湿度がRH45%以下ではほとんど殺菌効果を示さない。しかしRH45〜90%では良好な殺菌効果を示す。
Bacillus芽胞4種類を用いてオゾン濃度50ppm、温度10℃、5時間処理を行った結果、いずれの芽胞もRH62%以下ではほとんど殺菌効果が認められず、RH80〜95%で殺菌効果を示した。同様にしてClostridium芽胞6種類のオゾン殺菌効果を検討した結果、いずれの芽胞もRH52%以上で殺菌効果を示し、RH95%で殺菌効果が最も高かった。
(2)オゾン濃度
RH80%に調整したBacillus芽胞を同じRH、オゾン濃度5〜90ppm、温度10℃で1時間処理を行った結果、いずれの芽胞もオゾン濃度の増加に伴い殺菌効果は上昇した。同様にしてClostridium芽胞6種類のオゾン殺菌効果を検討した結果、いずれの芽胞もオゾン濃度の増加に伴い殺菌効果は上昇した。
(3)温度
熱に対する抵抗力の弱い微生物は、オゾンガス殺菌に及ぼす温度の影響は大きい。Pichia anomalaを用いてオゾン濃度4.0ppm、RH25%、温度30〜60℃で処理を行った結果、30℃、1〜5時間処理ではオゾン殺菌効果は認められず、50〜60℃においてオゾン殺菌効果が認められた。これは熱とオゾンでは殺菌機構が全く異なっているため、相乗効果が認められたと考えられる。

オゾン水殺菌

オゾン水は急速に自然分解し、酸素に戻るが、分解速度は水温pH、不純物の存在によりことなるが、常圧、20〜25℃の水温では半減期が10〜60分と速い。
(1)水温
オゾンによる殺菌は化学反応によるが、水温が上昇するとオゾンの分解が促進し、溶解度が減少しても消費量が増加して殺菌効果が上昇する場合がある。しかしオゾン濃度が一定の場合はオゾンと微生物の接触効率が関与し、またオゾン溶解度が上昇することで通常の場合、低温ほど殺菌効率が高い。さらに食品変敗微生物は病原微生物(主にグラム陰性菌)と異なり、オゾン処理時間がかかるため残留オゾン濃度が殺菌に及ぼす影響は大きい。理論的には水温が高いほどオゾンの溶解度が少なくても、オゾンの分解が速いので殺菌効果は大きいと考えられるが、その殺菌効果は菌種によって異なる。このため食品のオゾン水殺菌は品質への影響、ランニングコスト、微生物の接触時間等のため低温で行っている場合が多い。
(2)pH
オゾン水の分解の半減期は水質、特にpHに大きく影響を受けることが知られている。つまりpHが上昇すれば半減期が短くなり、残存オゾン濃度は減少する。pHの場合も水温と同様の関係がある。即ち、理論的にはpHが高くなるとオゾンの分解が促進し、残留オゾン濃度は減少するが殺菌効果は上昇する。この殺菌効果はオゾンの殺菌機構にも関与するが、菌種により著しい差異がある。アルカリ性下でのオゾン分解は極めて速くラジカルが生成して消滅するので的確に微生物に作用しない可能性がある。このため、水温と同様に食品変敗微生物の殺菌は低pHで行っている。
(3)オゾン濃度
細菌の栄養細胞の場合は0.3〜1.0ppmで容易に殺菌することができる。特に、薬剤に耐性のある乳酸菌や大腸菌群には特異的に殺菌効果が大きい。オゾン水殺菌濃度は上記のオゾン水濃度の範囲内ではオゾン水濃度が高いほど殺菌効果が大きい。芽胞の殺菌には栄養細胞の約10倍のオゾン水濃度が必要である。
(4)不純物(有機物、無機物)
一般的にオゾン水中の有機物や無機物はオゾン水の分解を促進する。アルカリ金属とオゾンとの反応を表3に示した。オゾンはナトリウム、カリウム、セシウムと反応してオゾナイドを形成する。またオゾン水の分解反応は、水酸イオンの他にも共存する種種の物質によって影響を与える。水中に溶存する無機物のオゾン分解反応に対する影響を表4に示した。オゾン分解を促進する銀イオンや銅イオン等の無機物、オゾン分解反応を抑制する塩素イオン等の無機物がある。オゾン水の分解に関与するものはこの反応の連鎖担体であるOHやHO2の生成を増大させたり、連鎖停止反応の効率を低下させることにより、オゾンの分解反応速度を増大させる作用を有するものをいう。例えば生物に対する影響が最も大きい金属イオンが酸化還元体からなり、還元剤として金属イオンが酸化され、酸化剤として金属イオンは還元されることによる。
表3 アルカリ金属とオゾンのオゾナイド
表4 オゾン水の分解に対する共存無機物質の影響

6.食品変敗微生物のオゾン殺菌

オゾンによる殺菌は溶菌と呼ばれ細菌の細胞壁の破壊や分解によるものと言われ、 塩素が細胞膜を通して酵素を攻撃する機構とは異なる。細菌の生存率をオゾン又は塩素でプロットしてみおると、塩素は濃度が増加するごとに殺菌力が増加するカーブを描いたが、オゾンはある一定の濃度に到達して殺菌力を示す特徴がある。

(1)細菌

他の殺菌剤と同様、オゾンの殺菌効果には選択性があり、ほとんどすべてのグラム陰性菌、大腸菌、大腸菌群、病原菌、蛍光菌、霊菌及びグラム陽性菌である乳酸菌などを急速に死滅させる。しかし大部分のグラム陽性菌、特に耐熱性芽胞は抵抗性が強く、高濃度のオゾンが必要である。細菌芽胞のオゾン耐性は胞子殻にあり、これを除去するとオゾン耐性はなくなる。さらに芽胞形成時の環境条件もオゾン耐性に影響する。例えばpHが酸性に傾くとオゾンの耐性が低下する。栄養細胞はオゾンにより比較的容易に殺菌されやすい。また栄養細胞のオゾン水殺菌では菌体の洗浄の効果が大きい。オゾン水殺菌する前に水で十分洗浄しておくと低濃度オゾン水で殺菌することができる。オゾンガス殺菌では環境と同様に菌体又は芽胞の水分含量が増加するに伴い殺菌効果が上昇する。これはオゾンが分解する時に生じる発生基の酸素及びオゾンが水に溶け分解する時に生じるヒドロキシラジカルによる反応が主体である。このため高水分ほど殺菌効果が増加する。さらにオゾンを殺菌に用いる場合、殺菌力を持つのはオゾンそのものではなく(直接酸化力は弱く)、オゾンが分解して時に生じる発生基の酸素から生じるヒドロキシラジカルが強く(間接酸化力は強い)、その強い酸化力による酸化作用で微生物を殺菌する。このため食品工場の湿度50%以下の乾燥した空気のオゾン殺菌は工夫しない限り極めて困難である。

(2)酵母

酵母はオゾンで容易に殺菌できる。Saccharomyces cerevisiaeをオゾン水で処理するとATP、酵素の多くが不活性化し、15種類の酵素のうちグルセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼが最も顕著に不活性化される。また0.1%のカフェイン添加によりオゾン殺菌効果が高まる。定常期の細胞より対数増殖期の細胞の方がオゾン感受性が高い。その理由として、出芽した細胞は容易にオゾンにより破壊される。酵母に対するオゾン抵抗も最も高いのが、Saccharomycopsis, 次いでCandida, Hansenula, Zygosaccharomyces, Saccharomyces, Torulopsis, Pichia, Rhodotorula, Shizosaccharomycesの順となる。

(3)カビ

カビに対するオゾン抵抗性は種類により著しく異なるが比較的オゾン抵抗性は強い。オゾンガス処理ではPenicilliumが最もオゾン感受性がある。業務用冷蔵庫の壁面に生育したPenicilliumはオゾン処理により青から白くなり、死滅する。オゾン水処理で最も抵抗力のあるのがCladosporium,次いでAureobasidium, Geotrichum, Trichoderma, Wallemia, Aspergillus, Penicillimである。

7.食品工場へのオゾンの利用技術

食品工場でオゾンを用いる主目的は工場内を清潔に保ち、なるべく菌数の少ない製品をつくることであるが、その最終的な目的は食品の微生物変敗を防止して保存性を高めることにある。現在、我が国で行われているオゾンを用いた食品変敗防止技術には以下の10の方法が採用され効果をあげている。

(1)多量の低濃度オゾン水(0.2〜0.6ppm)による食品及び食品原材料の洗浄殺菌

緑豆、大豆、浅漬、豆腐、カット野菜等の生野菜及び生鮮魚介類の洗浄殺菌 モヤシ、ネギ、カイワレ大根、ニンジン、ニラ、白菜、ゴボウ、小松菜、キャベツ、キュウリ、エノキ、シメジ、シイタケの洗浄・殺菌

(2)低濃度オゾンガスによる食品及び食品原材料の表面殺菌

小麦粉、そば粉、片栗粉及びその他の穀粉、乾麺、冷麦、半生めん、生めん、生そばの表面殺菌

(3)食品製造環境の夜間のオゾンガス殺菌

工場内の温度の変化による水の移動に伴う微生物の移動現象(工場微生物移動理論、内藤理論)による食品の変敗をオゾンガスで防止する。天井に配管したパイプよりオゾンを落下させ、上昇してくる微生物を殺菌する。

(4)食品製造工場環境の日中に床、側溝をオゾン水で洗浄

床に傾斜をつけてオゾン水を流して洗浄・殺菌する。他の薬剤で殺菌でき ない乳酸菌や大乳酸菌及び大腸菌群がターゲットとなる。
えびせんべい工場、和洋菓子工場、水産練り製品工場、パン製造工場、調理食品加工工場、米飯加工工場、食肉加工工場

(5)食品工場の業務用冷蔵庫及び冷凍庫のオゾンガス殺菌及び脱臭

冷蔵庫に生育する青かび(Penicillium)類の殺菌及び冷凍庫の脱臭。
水産加工食品、米飯加工食品、和洋菓子原材料、調理食品加工工場

(6)冷凍食品の解凍へのオゾン水の利用

魚類の解凍、農産加工食品の解凍、水産加工食品の解凍

(7)食品の包装時微量のオゾンガス又はオゾンの封入

水産加工食品へのオゾンガス封入、穀類加工食品のオゾンガスの封入、豆腐のオゾン水の封入、生鮮魚介類のオゾン水封入

(8)水産物や農産物のオゾン氷による鮮度保持

水産物の異臭分解・鮮度保持、農産物の異臭分解・鮮度保持

(9)オゾンガス及びオゾン水による食品原材料の脱色および脱臭

水産原材料のトリメチルアミンの分解、農産物の脱塩

(10)オゾンガスとオゾン水による農産物や水産物の鮮度保持

農産物貯蔵庫のエチレン分解へのオゾンガスの利用、水産物のオゾン水利用
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